使(shi)用(yong)G418篩(shai)選HEK-293T細胞的(de)詳細(xi)步(bu)驟

使(shi)用(yong)G418篩(shai)選HEK-293T細胞的(de)詳細(xi)步(bu)驟

1. 細(xi)胞培(pei)養：復(fu)蘇HEK-293T細(xi)胞，用(yong)合適的(de)培養基（如DMEM高(gao)糖培(pei)養基，含 10%胎牛血(xue)清(qing)等(deng)）在(zai)37℃、5% CO₂培(pei)養箱中培(pei)養，待細胞匯(hui)合度達80%-90% 時(shi)進(jin)行傳(chuan)代或轉(zhuan)染(ran)操(cao)作。

2. 確(que)定(ding)G418篩(shai)選濃(nong)度：如(ru)客戶所做，在(zai)96孔(kong)板中接(jie)種(zhong)細(xi)胞，設(she)置(zhi) 0 - 1100 μg/mL的(de)G418濃(nong)度梯度，用(yong)CCK8 檢(jian)測(ce)培(pei)養24小(xiao)時的(de)細胞活性，繪(hui)制(zhi)細胞活力圖，確(que)定(ding)HEK-293T細(xi)胞的(de)G418 最小致死量(liang)。

3. 轉(zhuan)染(ran)：將(jiang)目(mu)的(de)基因連接(jie)到(dao)pCDNA3.1載體(ti)上，使(shi)用(yong)合適的(de)轉(zhuan)染(ran)試(shi)劑（如(ru)Lipofectamine 3000 ），按照(zhao)試(shi)劑說明書將重組(zu)載體(ti)轉(zhuan)染(ran)到(dao)HEK-293T細胞中，轉(zhuan)染(ran)6小(xiao)時後換(huan)液。

4. 加藥篩(shai)選：轉(zhuan)染(ran)後1 - 2天(tian)，根據(ju)確(que)定(ding)的(de)最小致死量(liang)，加入適(shi)量(liang)G418進(jin)行篩(shai)選。可(ke)以先(xian)采(cai)用(yong)較(jiao)低(di)濃(nong)度篩(shai)選壹輪(lun)，比(bi)如最小致死量(liang)的(de) 1/2 - 2/3濃(nong)度，維(wei)持篩選2 - 3周，期(qi)間(jian)每2 - 3天(tian)換(huan)液並補(bu)充G418 。然後再(zai)用(yong)較(jiao)高濃(nong)度（接(jie)近(jin)或等(deng)於(yu)最小致死量(liang)）進(jin)行第(di)二(er)輪(lun)篩(shai)選1 - 2周。

5. 單克(ke)隆挑(tiao)選：待細胞形(xing)成單克(ke)隆後，用(yong)有(you)限稀(xi)釋(shi)法(fa)或細(xi)胞克(ke)隆環將單克(ke)隆細胞挑(tiao)選到96孔(kong)板(ban)中繼續培養，擴(kuo)大(da)培(pei)養後檢測(ce)目(mu)的(de)基因的(de)表(biao)達情況。

HEK-293T細胞篩(shai)選註意(yi)事(shi)項(xiang)

1. 細胞狀態：確(que)保用(yong)於(yu)轉(zhuan)染(ran)和(he)篩選的(de)HEK-293T細胞處(chu)於(yu)良好(hao)的(de)生長(chang)狀態，細(xi)胞活力應(ying)在(zai)90% 以(yi)上，且無支(zhi)原(yuan)體(ti)等(deng)汙染(ran)。

2. 轉(zhuan)染(ran)效率：優化(hua)轉(zhuan)染(ran)條(tiao)件，包(bao)括轉(zhuan)染(ran)試(shi)劑與(yu)DNA的(de)比例(li)、轉(zhuan)染(ran)時(shi)間等(deng)，以提(ti)高(gao)轉(zhuan)染(ran)效率。可(ke)設置(zhi)不(bu)同(tong)轉(zhuan)染(ran)條(tiao)件的(de)對(dui)照(zhao)組(zu)，確(que)定(ding)優良轉(zhuan)染(ran)方(fang)案。

3. G418質量(liang)：G418的(de)質量(liang)對(dui)篩(shai)選結果(guo)影(ying)響(xiang)較(jiao)大(da)，應(ying)選擇質量(liang)可(ke)靠(kao)的(de)產品(pin)，使(shi)用(yong)前(qian)檢查(zha)其(qi)效價和純(chun)度(du)，溶解(jie)後過濾除(chu)菌，-20 ℃保存(cun)。

4. 篩(shai)選濃(nong)度：篩(shai)選濃(nong)度需(xu)根據(ju)細(xi)胞活力圖結果(guo)和實驗(yan)經(jing)驗(yan)確(que)定(ding)，濃(nong)度過低(di)可(ke)能導(dao)致假陽(yang)性(xing)細(xi)胞過多(duo)，過高則(ze)可(ke)能殺(sha)死陽(yang)性(xing)細(xi)胞。

5. 換(huan)液頻率：篩(shai)選期間(jian)換(huan)液頻率不(bu)宜過高或過低(di)，過高可(ke)能導(dao)致細胞生(sheng)長(chang)受(shou)影(ying)響(xiang)，過低(di)可(ke)能使(shi)代(dai)謝(xie)廢物積累(lei)影(ying)響(xiang)細(xi)胞狀態和(he)篩選效果。

6. 無菌(jun)操(cao)作(zuo)：整個(ge)篩選過程需(xu)嚴(yan)格(ge)遵守(shou)無菌(jun)操(cao)作(zuo)規範，防止雜(za)菌(jun)汙(wu)染(ran)。

更(geng)多(duo)內(nei)容(rong)進(jin)入蘇(su)州(zhou)阿(e)爾法(fa)生(sheng)物進(jin)行了(le)解(jie)。