LightNing® ApaI內切酶(mei)是壹(yi)系列經過基(ji)因(yin)工程重(zhong)組(zu)的(de)快(kuai)速(su)限(xian)制(zhi)性內切酶(mei)，適用於(yu)質粒 DNA、PCR 產(chan)物(wu)或基(ji)因(yin)組 DNA 等的快速(su)酶(mei)切。所有(you) LightNing® 快速(su)內切酶(mei)在通用的 CutOne® 或 CutOne® Color Buffer 中都具(ju)有(you)優良(liang)的(de)活性，能(neng)夠在 5~15 分(fen)鐘(zhong)內完成酶(mei)切。

LightNing® ApaI內切酶(mei)組成

特性和用(yong)法(fa)

LightNing® ApaI內切酶(mei)，可在(zai)5~15 min內完成反(fan)應

u建議(yi)反應條(tiao)件(jian)

1× CutOne®緩(huan)沖液(ye)；

37℃溫育；

參照(zhao)“DNA 快速(su)酶(mei)切流程"配(pei)制反(fan)應體(ti)系。

u失活條(tiao)件(jian)

80℃溫育20 min。

u甲基(ji)化敏(min)感(gan)性

對於(yu)被 CpG 甲基(ji)化的(de) DNA，剪(jian)切可能(neng)受阻(zu)，

對於(yu)被 Dcm 甲基(ji)化的(de) DNA，剪(jian)切可能(neng)受阻(zu)。

u存(cun)儲(chu)條(tiao)件(jian)

-20℃

相(xiang)關(guan)問(wen)答

Q:為什(shen)麽(me)在CutOne® Buffer中加入(ru)HSA？

A:壹些(xie)酶(mei)在反(fan)應過程(cheng)中需要HSA的參(can)與，我(wo)們在(zai)CutOne® Buffer中添加(jia)了(le)HSA，避(bi)免反應中額(e)外(wai)添加(jia)組(zu)分，使得酶(mei)切反(fan)應更(geng)加(jia)便(bian)捷。

Q:HSA的添加(jia)對(dui)於雷(lei)霆(ting)系(xi)列(lie)限(xian)制(zhi)性內切酶(mei)的功(gong)能(neng)會(hui)產(chan)生(sheng)什(shen)麽(me)樣的影響？

A:在我(wo)們的(de)測(ce)試(shi)中未曾(zeng)發(fa)現HSA對於(yu)雷(lei)霆(ting)系(xi)列(lie)限(xian)制(zhi)性內切酶(mei)的功(gong)能(neng)有(you)任何(he)影(ying)響(xiang)。在有(you)些(xie)情況(kuang)下，對(dui)於部分的酶(mei)切反(fan)應有(you)促進(jin)作(zuo)用(yong)。

Q:我(wo)需要嚴(yan)格(ge)遵守5~15 min的酶(mei)切時(shi)間(jian)嗎？能(neng)夠延長(chang)反(fan)應時間(jian)嗎？

A:雷(lei)霆(ting)系(xi)列(lie)限(xian)制(zhi)性內切酶(mei)經過改造(zao)可以(yi)將酶(mei)切時(shi)間(jian)縮(suo)短(duan)至(zhi)5~15 min。同(tong)樣也(ye)消除(chu)了(le)限(xian)制(zhi)性內切酶(mei)的星(xing)活性（長(chang)時(shi)間(jian)反(fan)應造(zao)成的(de)非(fei)特異性消化），在(zai)說(shuo)明書中告(gao)知(zhi)的(de)星活性出現的(de)時間(jian)範(fan)圍內可以(yi)適當延(yan)長(chang)反(fan)應時間(jian)。

Q:我(wo)什(shen)麽(me)時候(hou)應當考(kao)慮星活性對於酶(mei)切反(fan)應的影(ying)響？

A:如果(guo)額(e)外(wai)的酶(mei)切條(tiao)帶(dai)對於(yu)實驗結(jie)果(guo)會產生(sheng)影(ying)響(xiang)時(shi)我(wo)們應當考(kao)慮星活性對於酶(mei)切反(fan)應的影(ying)響。例(li)如：進(jin)行(xing)基因(yin)型、突(tu)變(bian)型分析(xi)或(huo)克(ke)隆(long)時(shi)我(wo)們應當避(bi)免星活性的產生(sheng)。避(bi)免星活性的有(you)效方(fang)法(fa)：適當擴大(da)反應體(ti)積（較(jiao)小(xiao)的反(fan)應體(ti)積容易造(zao)成甘(gan)油體(ti)積達(da)到(dao)或超(chao)過總反(fan)應體(ti)積的(de)5%）；不(bu)進(jin)行(xing)超(chao)長(chang)時(shi)間(jian)孵(fu)育（過(guo)夜(ye)消化極易產生(sheng)星(xing)活性）。

Q:有(you)哪些(xie)關(guan)鍵因(yin)素會導(dao)致星活性？

A:長(chang)時(shi)間(jian)孵(fu)育、過(guo)量(liang)的酶(mei)、高甘(gan)油含(han)量（通常高於(yu)5%）、較(jiao)小(xiao)的反(fan)應體(ti)系等因(yin)素都會(hui)導(dao)致星活性的產生(sheng)。

Q:未經純(chun)化的(de)PCR產物(wu)直接(jie)酶(mei)切要怎(zen)樣設(she)定體(ti)系？

A:反應體(ti)系推(tui)薦(jian)由(you)這些(xie)內(nei)容組(zu)成：10 μl PCR產物(wu)、2 μl 10×CutOneTM Buffer、1~2 μl相(xiang)應的限(xian)制(zhi)性內切酶(mei)、ddH2O補(bu)齊(qi)到(dao)30 μl。酶(mei)的用(yong)量根(gen)據(ju)PCR產物(wu)的濃(nong)度(du)而定，只加(jia)入(ru)2 μl反應緩(huan)沖液(ye)的(de)原因(yin)是PCR反應中存(cun)在對(dui)應的鹽(yan)離子和金(jin)屬離子，適當減少反(fan)應緩(huan)沖液(ye)的(de)用量以(yi)保(bao)證最(zui)終(zhong)反(fan)應體(ti)系中的環(huan)境適宜限(xian)制(zhi)性內切酶(mei)發揮(hui)功(gong)能(neng)。

Q:限(xian)制(zhi)性內切酶(mei)簡並(bing)性識(shi)別(bie)位點壹定是(shi)回文的(de)嗎？

A:大(da)多數(shu)二(er)型限(xian)制(zhi)性內切酶(mei)的識(shi)別(bie)序列(lie)是(shi)回(hui)文的(de)，而且(qie)是(shi)特定的(de)堿基(ji)序列。然而有(you)些(xie)限(xian)制(zhi)性內切酶(mei)具有(you)簡並(bing)性識(shi)別(bie)位點，也(ye)就是說(shuo)識(shi)別(bie)位點中有(you)壹個(ge)或(huo)以(yi)上(shang)的(de)堿基(ji)對是非(fei)特異的（例(li)如：BsrfI識(shi)別(bie)5’RCCGGY, R=A/G, Y=C/T）。對於(yu)這樣的具有(you)簡並(bing)性識(shi)別(bie)位點的限(xian)制(zhi)性內切酶(mei)，只要是(shi)符(fu)合要求(qiu)的序(xu)列皆能(neng)被(bei)識(shi)別(bie)並(bing)且(qie)被(bei)正(zheng)確地切割(ge)（例(li)如5’ ACCGGC, 5’ ACCGGT, 5’ GCCGGC, 和5’ GCCGGT，其中兩(liang)個(ge)並(bing)不(bu)是(shi)回(hui)文的(de)，仍(reng)然能(neng)被(bei)BsrFI識(shi)別(bie)並(bing)且(qie)切割(ge)）。