大腸(chang)桿菌質粒 DNA 的提取（堿(jian)裂(lie)解法(fa)）

此方法(fa)適(shi)用於小(xiao)量質粒DNA 的提(ti)取(qu)提(ti)取的(de)質粒 DNA 可直(zhi)接(jie)用(yong)於酶(mei)切(qie)PCR 擴(kuo)增(zeng)。

1.   取(qu) 1.5ml 細(xi)菌培(pei)養(yang)物於 EP 管(guan)中， 4000rpm  離(li)心(xin) 1 分鐘， 棄(qi)上(shang)清液， 使(shi)細(xi)菌沈 澱盡量幹燥(zao)；

2.   將細(xi)菌沈澱重懸於用冰預冷(leng)的 100 μl 溶液 I (50 mmol/L 葡(pu)萄糖(tang)， 10 mmol/L EDTA pH 8.0 ，25 mmol/LTris-HCl pH 8.0)  中，劇烈振(zhen)蕩；

3.   加(jia)入(ru) 200 μl 新配(pei)制(zhi)的(de)溶(rong)液 II(0.2 mol/L NaOH ，1％SDS（m/v）)，蓋(gai)緊 EP 管 口(kou)，快速顛倒(dao)離心(xin)管 5 次(ci)，以(yi)混(hun)合混(hun)合物，確保(bao)離(li)心(xin)管的整(zheng)個(ge)內表面與溶(rong)液 II 接(jie)觸，不要(yao)渦旋，置(zhi)於冰浴中；

4.   加(jia)入(ru) 150 μl 預冷溶(rong)液 III(每(mei) 100 ml  的(de)溶(rong)液 III 中含(han) 60 ml 5 mol/L   乙(yi)酸(suan)鉀(jia)，11.5 ml 冰乙(yi)酸(suan)， 28.5 ml H2O)，蓋(gai)緊 EP 管口(kou)，反(fan)復顛倒(dao)數次(ci)，使(shi)溶液 III 在(zai)粘稠 的(de)細(xi)菌裂(lie)解物(wu)中分散(san)均勻，之後將(jiang)管置(zhi)於冰上 3~5 分(fen)鐘；

5.   在最(zui)大轉(zhuan)速(su)下(xia)離心(xin) 5min，取上清(qing)液於另壹新 EP 管(guan)；

6.   用(yong)兩(liang)倍體積的乙(yi)醇(chun)室(shi)溫(wen)沈澱雙鏈 DNA，振(zhen)蕩(dang)混(hun)合於室溫(wen)放(fang)置 2 分(fen)鐘， 最(zui)大轉(zhuan) 速(su)離(li)心(xin) 5 分鐘；

7.   小(xiao)心(xin)吸去上清(qing)液，將離心(xin)管倒(dao)置於濾紙(zhi)上(shang)，以(yi)使(shi)所有(you)液體都(dou)流出(chu)，在將(jiang)附於管壁(bi)的液滴(di)除(chu)盡；

8.   加(jia) 1ml 70％乙(yi)醇(chun)洗(xi)滌沈澱，振蕩混(hun)合，用 12,000g 離(li)心(xin) 2 分鐘，棄(qi)上(shang)清，將(jiang) 開口(kou)的 EP 管(guan)置於室溫(wen)使(shi)乙(yi)醇(chun)揮發(fa)， 直(zhi)至(zhi) EP 管中內沒(mei)有(you)可見(jian)的液體存(cun)在（5 ~ 10 分(fen)鐘），用(yong)適(shi)量的 ddH2O 溶解；

9.   用(yong) 0.5μl 的(de) RNase 37℃溫(wen)育 5~10 分鐘；

10. 電泳鑒定。

乙(yi)醇(chun)沈澱DNA

1.    加(jia)入(ru) 1/10 體積的乙(yi)酸(suan)鈉(na)（3mol⁄L，PH=5.2）於 DNA 溶(rong)液中充(chong)分混(hun)勻， 使(shi)其(qi) 最(zui)終(zhong)濃(nong)度為(wei) 0.3 mol⁄L；

2.    加(jia)入(ru) 2 倍體積用冰預冷(leng)的乙(yi)醇(chun)混(hun)合後再(zai)次(ci)充(chong)分混(hun)勻置於-20℃中 15~30 分(fen)鐘；

3.    12,000 g 離心(xin) 10 分鐘，小(xiao)心(xin)移出(chu)上清(qing)液，吸去管壁(bi)上所有(you)的(de)液滴(di)；

4.    加(jia)入(ru) 1/2  離心(xin)管容(rong)量的 70％乙(yi)醇(chun)， 12000g  離心(xin) 2 分鐘， 小(xiao)心(xin)移出(chu)上清(qing)液， 吸 去管壁(bi)上所有(you)的(de)液滴(di)；

5.    於室溫(wen)下(xia)將開(kai)蓋(gai)的 EP 管的置(zhi)於實(shi)驗(yan)桌(zhuo)上(shang)以(yi)使(shi)殘(can)留的(de)液體揮發(fa)至(zhi)幹；

6.    加(jia)適(shi)量的 ddH2O 溶解 DNA 沈澱。

酶(mei)  切(qie)

1.   酶(mei)切(qie)前(qian)確定待(dai)切(qie)樣(yang)品(pin)的(de)濃度,  並選(xuan)擇(ze)合(he)適(shi)的限(xian)制(zhi)性(xing)內切(qie)酶(mei)和(he)配(pei)套 Buffer。 2.   在離心(xin)管中加(jia)入(ru)如(ru)下(xia)成(cheng)分(fen)：

10 ×Buffer     1μl

待(dai)切(qie)樣(yang)品(pin)  xμl

酶(mei)        0.5-1μl

加(jia)水補足 10μl

3.   混(hun)勻樣(yang)品(pin)並(bing)短暫離(li)心(xin)使(shi)樣(yang)品(pin)沈於管底(di)。

4.   將(jiang)離(li)心(xin)管置於 37℃中溫育 1-3hr，若待(dai)切(qie)樣(yang)品(pin)為(wei) PCR 產(chan)物(wu)， 則可將(jiang)反(fan)應時(shi)間(jian) 適(shi)當延(yan)長(chang)。

5.   用(yong)未酶(mei)切(qie)的(de)質(zhi)粒作為對照(zhao)，瓊(qiong)脂(zhi)糖(tang)電泳鑒定酶(mei)切(qie)結(jie)果。

註(zhu)：當酶(mei)切(qie)樣(yang)品(pin)用(yong)於回收而(er)不是(shi)鑒定時(shi)，可按(an)比例適(shi)當加(jia)大反(fan)應體(ti)積(ji)。雙酶(mei) 切(qie)可選(xuan)用二者活(huo)性(xing)都(dou)較高(gao)的 Buffer 或(huo)者通(tong)用(yong) Buffer，但要(yao)註(zhu)意不能(neng)有(you)星(xing)反(fan)應。）

連(lian) 接(jie)

1.   連(lian)接前(qian)先(xian)電泳確定待(dai)連(lian)接載體(ti)與片(pian)段的(de)濃(nong)度。

2.   在(zai)離(li)心(xin)管中加(jia)入(ru)如(ru)下(xia)成(cheng)分(fen)：

10 ×連(lian)接 Buffer 1μl

待連(lian)接的(de)樣(yang)品(pin)（膠(jiao)回收產(chan)物(wu)或(huo) PCR 產(chan)物(wu)，載體(ti)與片(pian)段的(de) mol 比為 1∶3-5）

連(lian)接酶(mei) 0.5-1μl                                                                            

加(jia)水補足 10μl

3.   混(hun)勻樣(yang)品(pin)並(bing)短暫離(li)心(xin)使(shi)樣(yang)品(pin)全(quan)部沈於管底(di)。

4.   將(jiang)離(li)心(xin)管置於連(lian)接酶(mei)要(yao)求(qiu)的(de)溫(wen)度孵(fu)育適(shi)當的(de)時間(jian)（根據不同(tong)公司的(de)酶(mei)的要(yao)求(qiu)

而(er)定， 壹般(ban)為 22℃ 1-3hr 或(huo) 16℃連(lian)接過(guo)夜(ye)）。

連(lian)接完(wan)的(de)樣(yang)品(pin)可直(zhi)接(jie)用(yong)於轉(zhuan)化，也(ye)可放(fang) 4℃冰箱(xiang)短期保(bao)存(cun)。