重組蛋(dan)白(bai)表(biao)達技(ji)術(shu)要點(dian)

大腸(chang)桿(gan)菌（E.coli）表達重組蛋(dan)白(bai)的(de)技(ji)術(shu)經(jing)過多(duo)年(nian)的(de)發展，已(yi)經(jing)成為(wei)壹個(ge)非常(chang)成熟(shu)表達系統。為了在大腸(chang)桿(gan)菌表達體系中(zhong)獲(huo)得(de)可(ke)溶(rong)以高表達產量(liang)的(de)蛋(dan)白(bai)，壹(yi)個(ge)優秀的表達策略是(shi)重要的。
為(wei)了高效(xiao)表達有活(huo)性(xing)蛋白(bai)，壹(yi)般需(xu)考慮(lv)以下(xia)幾(ji)個(ge)因素(su)：
1.宿(xiu)主體系的(de)選(xuan)擇
細(xi)菌、酵(jiao)母、哺(bu)乳動(dong)物(wu)細(xi)胞(bao)、絲狀(zhuang)真菌和單細(xi)胞(bao)藻類均可以作為(wei)表(biao)達宿(xiu)主，每(mei)壹種(zhong)表達宿(xiu)主都(dou)有各(ge)自的優缺點(dian)。如(ru)果需(xu)要表達的蛋白(bai)具(ju)有真核(he)的翻譯(yi)後修飾（糖(tang)基(ji)化(hua)修飾），那麽(me)可以(yi)選(xuan)擇酵(jiao)母、哺(bu)乳動(dong)物(wu)細(xi)胞(bao)等，而大腸(chang)桿(gan)菌等原核(he)表達體系則(ze)不(bu)適(shi)用(yong)。
大腸(chang)桿(gan)菌作為表達外源蛋(dan)白(bai)廣(guang)泛體系，其優點(dian)主要包括：（1）菌體繁殖速(su)度快(kuai)，20分鐘(zhong)即繁殖壹代(dai)，如(ru)果按照1/100的(de)比例(li)進行(xing)接(jie)種(zhong)（MOI），只(zhi)需(xu)要對(dui)其培養(yang)幾個(ge)小(xiao)時(shi)即可到達穩定期；（2）容易(yi)實現高密度培養(yang)，理(li)論培養(yang)密度是1×10^13 cells/ml，實際(ji)培養(yang)過程(cheng)中(zhong)如(ru)果使(shi)用(yong)的是(shi)LB培養(yang)基(ji)，在37℃培養(yang)密度壹般比1×10^10 cells/ml略小(xiao)。而在低溫(wen)（<11℃）誘導蛋白(bai)表(biao)達時(shi)，細(xi)菌個數幾乎不(bu)增長(chang)。（3）比較容易(yi)轉染(ran)外(wai)源DNA，質粒轉染(ran)效(xiao)率(lv)非常(chang)高。
2.質粒的選(xuan)擇
壹般來說(shuo)，重組蛋(dan)白(bai)表(biao)達質粒載體(ti)融合了復(fu)制(zhi)子(zi)(Replicon)、啟(qi)動子(zi)(promoter)、親(qin)和(he)標(biao)簽(qian)(affinity tags)、篩選(xuan)標(biao)記(ji)(selection marker)、多克隆(long)位點(dian)（MCS）和(he)融合蛋白(bai)去除(chu)策(ce)略(lve)(fusion tag removal strategy)，如(ru)下(xia)圖所示(shi)：
 
復(fu)制(zhi)子(zi)：包含復(fu)制(zhi)起(qi)始(shi)點(dian)及(ji)相(xiang)關(guan)順式(shi)作(zuo)用(yong)控(kong)制(zhi)元件(jian)（cis-acting control elements）。在選(xuan)擇質粒載體(ti)時(shi)，質粒拷(kao)貝(bei)數是(shi)壹個非常重要參數(shu)，應(ying)重點(dian)考慮(lv)。目前(qian)可從(cong)市(shi)場上(shang)購(gou)買到的(de)載(zai)體非常(chang)多，如(ru)pET、pUC、pACYC 、pBAD和(he)pSC101等。pET系列載(zai)體(ti)含(han)有pMB1起(qi)始子(zi)，在單個菌體中(zhong)該類(lei)質(zhi)粒的拷(kao)貝(bei)數通(tong)常為(wei)15-60；pUC系列(lie)含(han)有壹(yi)個突變(bian)的(de)pMB1起始子(zi)，在該系列(lie)的載(zai)體(ti)在單個細(xi)菌中(zhong)的拷(kao)貝(bei)數通(tong)常為(wei)500–700；pACYC和pBAD系(xi)列(lie)常(chang)被(bei)用(yong)於雙(shuang)表(biao)達體系，如(ru)FRET系(xi)統，該系列(lie)含有p15A起(qi)始子(zi)，單個細(xi)胞(bao)中(zhong)質粒的拷(kao)貝(bei)數為(wei)10-12；pSC101系列載體在單個細(xi)胞(bao)中(zhong)的拷(kao)貝(bei)數較(jiao)少，通(tong)常<5個(ge)，此類(lei)載(zai)體(ti)常被(bei)用(yong)於三種(zhong)蛋白(bai)的(de)共表達。
啟(qi)動子(zi)：在重組蛋(dan)白(bai)大腸(chang)桿(gan)菌表達體系中(zhong)，有多(duo)種(zhong)啟(qi)動子(zi)，入Lac、tac、T7、pL、cspA啟(qi)動子(zi)等。lac啟(qi)動子(zi)是最為(wei)常(chang)用(yong)的啟(qi)動子(zi)之(zhi)壹(yi)，當培養(yang)基(ji)中(zhong)只(zhi)有乳糖(tang)（lactose）作為(wei)碳(tan)源時(shi)，lac啟(qi)動子(zi)被(bei)激(ji)活，開始(shi)表(biao)達重組蛋(dan)白(bai)。T7啟(qi)動子(zi)作為另(ling)外(wai)壹種(zhong)經(jing)常使(shi)用(yong)的啟(qi)動子(zi)，當含有T7啟(qi)動系(xi)統的質粒轉染(ran)進入細(xi)菌後，培養(yang)至壹(yi)定濃(nong)度後，加(jia)入IPTG（異(yi)丙(bing)基(ji)-β-D-硫(liu)代(dai)吡(bi)喃(nan)半(ban)乳糖(tang)苷，壹(yi)種(zhong)非水(shui)解(jie)性(xing)的乳糖(tang)類似物）即可誘導大腸(chang)桿(gan)菌表達重組蛋(dan)白(bai)。
抗性(xing)篩選(xuan)標(biao)簽(qian)：質粒載體(ti)通(tong)常采(cai)用(yong)的抗性(xing)基(ji)因包(bao)括氨(an)芐(bian)青(qing)黴(mei)素(su)，卡那黴(mei)素(su)，氯(lv)黴(mei)素(su)，慶(qing)大黴(mei)素(su)和(he)四環素(su)等(deng)抗性(xing)基(ji)因，在重組蛋(dan)白(bai)表(biao)達與(yu)純化(hua)過程(cheng)中(zhong)，大部(bu)分(fen)加(jia)入的(de)外源(yuan)抗生(sheng)素(su)自(zi)然降解(如(ru)氨(an)芐(bian)青(qing)黴(mei)素(su)37℃條(tiao)件(jian)下(xia)半衰(shuai)期(qi)為(wei)16小(xiao)時(shi))或被(bei)去除(chu)掉(diao)，只(zhi)剩下(xia)微(wei)量(liang)殘留（壹(yi)般<1pg/ml純化(hua)蛋白(bai)），我(wo)們(men)開發了相(xiang)應(ying)的(de)ELISA試(shi)劑(ji)盒(he)能(neng)夠(gou)快(kuai)速(su)檢測抗生(sheng)素(su)殘留量(liang)（檢測靈(ling)敏度0.1pg/ml）。
融合標(biao)簽(qian)：為了(le)使(shi)蛋白(bai)的(de)下(xia)遊(you)純化(hua)過程(cheng)更加(jia)容易(yi)以(yi)及(ji)促(cu)進某(mou)些不(bu)溶(rong)性(xing)蛋白(bai)可(ke)溶(rong)表(biao)達，通(tong)常在表達目標(biao)蛋(dan)白(bai)的(de)N端(duan)或C端(duan)會(hui)加(jia)入融合標(biao)簽(qian)。融合標(biao)簽(qian)可分(fen)兩類(lei)：壹(yi)類是(shi)短肽類(lei)標(biao)簽(qian)；壹類(lei)是長(chang)肽(tai)類(lei)標(biao)簽(qian)，主要以融合蛋白(bai)（fused partner）形(xing)式(shi)共表達。短肽標(biao)簽(qian)主要作用(yong)是使(shi)蛋白(bai)下(xia)遊(you)純(chun)化(hua)更加(jia)快(kuai)捷高效(xiao)，長(chang)肽(tai)類(lei)標(biao)簽(qian)更多(duo)的(de)作用(yong)是促(cu)進蛋(dan)白(bai)可(ke)溶(rong)性(xing)表達；短肽類(lei)標(biao)簽(qian)壹般只(zhi)含幾(ji)個(ge)氨(an)基(ji)酸(suan)，分(fen)子(zi)量(liang)壹(yi)般小於2 kDa，對(dui)重組蛋(dan)白(bai)的(de)性(xing)質影響(xiang)較小(xiao)。親(qin)和(he)標(biao)簽(qian)可以(yi)放置在蛋白(bai)的(de)C-端(duan)或N-端(duan)，如(ru)需(xu)要表達分泌性(xing)蛋白(bai)，壹(yi)般放置於(yu)C-端(duan)，信號(hao)肽通(tong)常放置於(yu)N-端(duan)。不(bu)同的(de)蛋白(bai)標(biao)簽(qian)需(xu)要根(gen)據(ju)具(ju)體案(an)例(li)來分析，常用(yong)的蛋(dan)白(bai)標(biao)簽(qian)性(xing)質，如(ru)下(xia)表所示(shi)
 
標(biao)簽(qian)去除(chu)的(de)酶(mei)切位點(dian)：對(dui)於壹般性(xing)的生(sheng)物(wu)學(xue)研究，蛋(dan)白(bai)標(biao)簽(qian)可以(yi)不用(yong)去除(chu)，如(ru)pull down實驗(yan)和(he)CO-IP實驗(yan)，通(tong)常需(xu)要保留(liu)標(biao)簽(qian)(如(ru)GST、His標(biao)簽(qian)等)以(yi)便將(jiang)目的蛋白(bai)從(cong)混(hun)合物中(zhong)直接(jie)分(fen)離(li)出來。當涉及(ji)到(dao)蛋白(bai)結(jie)構(gou)研究時(shi)，則需(xu)要去除(chu)目(mu)標(biao)蛋(dan)白(bai)的(de)融合標(biao)簽(qian)或融合伴侶(lv)。去除(chu)蛋(dan)白(bai)標(biao)簽(qian)的方(fang)法可(ke)分為兩類(lei)，壹(yi)類是(shi)酶消化(hua)法；壹(yi)類(lei)是化(hua)學裂(lie)解法。化(hua)學裂(lie)解法通(tong)產被(bei)用(yong)於融合伴侶(lv)蛋白(bai)的(de)去除(chu)，如(ru)CNBr用(yong)於裂(lie)解與(yu)Met氨(an)基(ji)酸(suan)C-端(duan)連(lian)接(jie)的(de)多(duo)肽(tai)，該(gai)方法優點(dian)是(shi)價(jia)格便(bian)宜，缺點(dian)是(shi)蛋(dan)白(bai)序(xu)列中(zhong)不能(neng)存在其他的Met殘基(ji)。另(ling)壹(yi)種(zhong)最為(wei)常(chang)用(yong)的蛋(dan)白(bai)標(biao)簽(qian)去除(chu)方(fang)法(fa)為酶(mei)消(xiao)化(hua)法，如(ru)腸(chang)激脢(脢)（Enterokinase），凝(ning)血酶（thrombin），factor Xa和(he)煙草蝕紋(wen)病毒蛋(dan)白(bai)酶(mei) (TEV protease)等(deng)移(yi)除(chu)蛋(dan)白(bai)標(biao)簽(qian)，使(shi)用(yong)酶法(fa)進行(xing)標(biao)簽(qian)的切(qie)除(chu)通(tong)常會(hui)殘留少(shao)數(shu)幾個氨(an)基(ji)酸(suan)殘基(ji)。其(qi)中(zhong)帶有His標(biao)簽(qian)的TEV作(zuo)為壹(yi)個被(bei)廣(guang)泛用(yong)於蛋(dan)白(bai)標(biao)簽(qian)去除(chu)實驗(yan)的(de)標(biao)簽(qian)，其具(ju)有壹(yi)個非常優秀的特點(dian):在切除(chu)標(biao)簽(qian)後，只(zhi)殘留壹(yi)個(ge)Ser或Gly殘基(ji)或不殘留氨(an)基(ji)酸(suan)殘基(ji)。
3.蛋(dan)白(bai)表(biao)達宿(xiu)主的選(xuan)擇
在使(shi)用(yong)大腸(chang)桿(gan)菌表達重組蛋(dan)白(bai)時(shi)，常采(cai)用(yong)BL21（DE3）和K-12衍(yan)生(sheng)菌株作為表(biao)達宿(xiu)主。Studier 於1986年(nian)提出BL21菌株，隨後不(bu)同(tong)基(ji)因工(gong)程(cheng)修飾菌株相(xiang)繼(ji)誕(dan)生(sheng)。BL21菌株缺乏(fa)Lon蛋白(bai)酶(mei)和(he)外(wai)膜蛋白(bai)酶(mei)OmpT。Lon蛋(dan)白(bai)酶(mei)主要功(gong)能(neng)是(shi)降解外(wai)源蛋白(bai)，外(wai)膜蛋白(bai)酶(mei)OmpT主要功(gong)能(neng)是(shi)降解胞(bao)外基(ji)質(zhi)蛋(dan)白(bai)。同(tong)時(shi)BL21菌株具(ju)有先天性(xing)的hsdSB基(ji)因突變(bian)，菌株失去甲基(ji)化(hua)和降(jiang)解(jie)外源(yuan)轉染(ran)質(zhi)粒的能(neng)力(li)，使(shi)得(de)質(zhi)粒能(neng)夠(gou)傳(chuan)代(dai)保留(liu)至(zhi)子(zi)代細(xi)菌中(zhong)（hsdSB突變(bian)基(ji)因來源於(yu)父(fu)輩B834菌株）。另壹種(zhong)時(shi)K-12系列(lie)菌株，該系列(lie)菌株具(ju)有兩大優點(dian)：壹(yi)個(ge)是能(neng)夠(gou)促(cu)進胞(bao)質中(zhong)蛋白(bai)二(er)硫(liu)鍵(jian)的形成(cheng)(主要原因是(shi)trxB（thioredoxin reductase）基(ji)因發生(sheng)突變(bian))；另(ling)壹個是(shi)外源質(zhi)粒能(neng)夠(gou)在宿(xiu)主菌種(zhong)中(zhong)穩定存在(主要原因時(shi)recA基(ji)因發生(sheng)了(le)突變(bian))。
常(chang)見的重組蛋(dan)白(bai)表(biao)達技(ji)術(shu)問題匯(hui)總
重組蛋(dan)白(bai)表(biao)達永遠不(bu)是(shi)壹蹴(cu)而就的事(shi)情(qing)，任何(he)壹(yi)種(zhong)方案(an)不(bu)會(hui)適用(yong)於所(suo)有案(an)例(li)，蛋白(bai)表(biao)達可以說(shuo)是(shi)壹個不斷(duan)嘗(chang)試(shi)的過(guo)程，下表(biao)總結(jie)了(le)壹些(xie)常見的蛋白(bai)表(biao)達技(ji)術(shu)問題及(ji)其(qi)應(ying)對(dui)策略。
 
更多(duo)蛋(dan)白(bai)組(zu)學(xue)實驗(yan)設(she)備(bei)、實驗(yan)室試劑(ji)、生(sheng)物(wu)耗材(cai)采(cai)購(gou)等進入蘇(su)州阿爾(er)法(fa)生(sheng)物(wu)實驗(yan)器(qi)材(cai)有限(xian)公司(si)了(le)解。